EFECTOS DEL REACTIVO LUMINOL FRENTE A LA OBTENCIÓN DE ADN
Introducción:
Durante una investigación criminalística, la identificación y análisis de manchas de sangre suponen una fuente importante de información que contribuyen a la resolución del delito. Asimismo, con el fin de dificultar la tarea investigativa, o por el propio paso del tiempo o factores ambientales, la sangre no siempre está presente a simple vista en la escena del crimen. Por lo tanto, la detección de sangre que ha sido limpiada o eliminada forma parte esencial en el desarrollo de la investigación.
Con el paso del tiempo y los avances científicos, se fueron diseñando diferentes metodologías que hicieron posible la visualización de manchas de sangre removidas en el lugar del hecho o en objetos relacionados con el delito. Una de las técnicas más conocidos y utilizadas es la de quimioluminiscencia, que consiste en la aplicación de reactivos químicos (conocidos normalmente como “Luminol”) sobre las superficies investigadas, a fin de generar una reacción química con compuestos presentes en la sangre, que produce luz visible al ojo humano.
Si bien esta técnica es muy utilizada en la actualidad, existe cierta discrepancia bibliográfica respecto de las desventajas que supone la aplicación de este método. La desventaja principal que mencionan algunos autores consiste en la posibilidad de que el reactivo dañe las moléculas de ADN presentes en la sangre, al punto de dificultar posteriormente una pericia genética.
En este artículo se muestran los procedimientos y resultados de la investigación realizada por la Licenciada en Criminalística Yesica MARQUEZ, quien efectúo una serie de ensayos controlados a fin de evaluar la capacidad de obtener un perfil genético a partir de muestras de sangre recolectadas luego del lavado y posterior revelado mediante Luminol.
Importancia de la prueba genética en la criminalística
El ADN es la macromolécula responsable de la herencia genética, y está presente en las células de todos los seres vivos. La genética forense se encarga del análisis de los polimorfismos del ADN, responsables de la variabilidad genética en la población humana, aplicados a los problemas judiciales, tales como investigaciones de paternidad, investigaciones criminales especializadas en homicidios y delitos sexuales; o bien en la identificación de restos cadavéricos.
El ADN es una de las herramientas más importantes para esta ciencia, ya que a partir de él se puede identificar un individuo. En virtud de ello, se pueden utilizar diversas técnicas de genética forense para identificar a una persona a través de la comparación entre la muestra de referencia y las muestras halladas en la escena del crimen.
¿Qué muestras contienen ADN?
Al momento de inspeccionar la escena del crimen o lugar del hecho, donde se sospecha que ha ocurrido un acto violento, los indicios relevantes para la obtención de ADN suelen ser de origen biológico, tales como: la sangre, la saliva, fluido seminal, fluidos mixtos (semen-sangre-epitelios) tanto en estado fresco como en soporte sólido, como así también tejido cadavérico, musculo, piel, huesos, uñas, filamentos pilosos y dientes. Estos indicios pueden estar a simple vista, como manchas o fragmentos dispersos en el lugar; pueden hallarse de manera indirecta, como aquellos presentes en peines, cepillo de ropa, de dientes, de uñas, tarjetas, sobres, colillas, restos de utensilios (vasos, tazas, cubiertos, afeitadoras, etc.), así como también en prótesis dentales, cosméticos, ropas, calzados, anillos, relojes, etc.; o bien pueden estar en estado latente, es decir, no ser visibles a simple vista, y requerir de algún proceso físico o químico para su revelado.
Esto es justamente lo que interesa a este artículo, ya que se basa en el análisis de evidencia revelado por quimioluminiscencia.
¿Qué es el Luminol?
En el año 1928 se descubre accidentalmente que el compuesto 5-amino-2,3-dihidroftalazina-1,4-diona emite luz al entrar en contacto con peróxido de hidrógeno (agua oxigenada) junto con algún catalizador como Cobre, Cobalto o Hierro. Esa luz se genera a raíz de la energía que desprende la reacción química entre estos compuestos. Dado este descubrimiento, comenzó a utilizarse en minería para la detección de trazas de cobre en Alemania.
Su uso en las ciencias forenses no tarde en llegar, gracias al Dr. Walter Spech de la Universidad de Medicina Legal y Criminalística de Jena, Alemania en el año 1937. A partir de ese año se comenzaron a realizar ensayos de detección de sangre en diferentes superficies, gracias a la presencia de hierro en la hemoglobina de la sangre. La reacción de quimioluminiscencia del Luminol puede generarse naturalmente y en forma gradual y lenta ante la presencia de un agente oxidante como el agua oxigenada, pero la presencia de Hierro en estado oxidado de la sangre acelera la reacción, generando una luminiscencia instantánea.
A partir del 1950 comienza a tomar relevancia en la investigación de casos criminales, y se comienzan a probar fórmulas mejoradas del Luminol a partir de diferentes mezclas, hasta la llegada de la fórmula propuesta por Weber en 1966, que consistía en una solución de hidróxido de sodio o de potasio junto con agua oxigenada, dando como resultado un Luminol con mayor sensibilidad. Esta mezcla fue ampliamente utilizada a nivel mundial hasta el surgimiento de nuevas fórmulas, como la fórmula casera de Grodsky, o preparados comerciales que brindaban otras ventajas, como facilidades para su aplicación o mayor reactividad.
Importancia del Luminol en la Criminalística
Debido a lo expuesto anteriormente, este reactivo es utilizado para revelar rastros latentes (diluidos por lavado) de restos de sangre en diversas superficies (lisas, porosas, absorbentes, etc.), como así también pequeñas cantidades de sangre que no son visibles al ojo humano, ya sea en el lugar de los hechos como así también en el laboratorio sobre los objetos relacionados.
La detección de manchas hemáticas, tanto en la escena del crimen como en el laboratorio, son vitales en la investigación criminal, ya que el hallazgo de tejido hemático permite relacionarlos directamente con el hecho, y pueden brindar, además, información genética que lleve a la identificación fehaciente del autor o la víctima.
Es importante mencionar que el Luminol no reacciona frente a fluidos corporales tales como sudor, saliva, semen y orina, mientras que en contacto con tejido hemático la quimioluminiscencia aumenta lentamente su brillo durante un periodo de varios minutos. Sin embargo, el resultado positivo para la presencia de luminiscencia no indica categóricamente la presencia de sangre, ya que el Luminol también arroja resultados positivos frente a diversos materiales, tales como raíces vegetales, tinturas/colorantes, metales o productos de limpieza. Asimismo, la quimioluminiscencia producida de la interacción del Luminol con estos materiales disminuye hasta desaparecer en un período de tiempo no mayor a 1 minuto, este efecto es conocido como Falso-Positivo.
Desarrollo de la investigación
Para proceder a la investigación, se seleccionaron CUATRO (04) elementos de características porosas; CUATRO (04) de superficie lisa; CUATRO (04) elementos metálicos; y CUATRO (04) elementos absorbentes. Todos estos fueron contaminados con sangre humana y luego sometidos a lavado con diferentes modalidades. Luego se les aplicaron diferentes reactivos de Luminol y se efectuaron levantamientos para análisis de ADN. Todos estos procedimientos se resumen a continuación:
Obtención de la muestra de sangre
Para el desarrollo de la investigación fue necesaria la obtención de sangre humana, la cual se llevó a cabo mediante la extracción por punción venosa de un voluntario masculino, extrayendo un total de 10 mililitros, los cuales fueron colocados en tubos con EDTA como anticoagulante.
Preparación de las muestras
Muestras absorbentes: CUATRO (04) fragmentos de toalla blanca de uso cotidiano, los cuales fueron impregnados con cuatro gotas de sangre cada uno, numerándolos como I, II, III y IV.
Muestras de superficie lisa: CUATRO (04) fragmentos de adornos de cerámica, los cuales fueron impregnados con cuatro gotas de sangre cada uno, numerándolos como I, II, III y IV.
Muestras de superficie metálica: CUATRO (04) llaves plateadas con superficie acanalada, las cuales fueron impregnados con cuatro gotas de sangre cada una, numerándolas como I, II, III y IV.
Muestras de superficie porosa: UN (01) fragmento de madera oscura, el cual se dividió en CUATRO (04) áreas, las cuales fueron impregnadas con cuatro gotas de sangre cada una, numerándolas como I, II, III y IV.
Luego de la impregnación con sangre, cada soporte se dejó secar por 24 horas a temperatura ambiente, en condiciones controladas para evitar contaminaciones.
Estas muestras fueron distribuidas en CUATRO grupos, cada uno conformado por UN (01) elementos por cada tipo de superficie, quedando en el GRUPO I, los elementos I de la superficie lisa, porosa, metálica y absorbente. Lo mismo para los grupos II, III y IV.
Lavados/Limpiezas de las muestras:
Se efectuaron DOS tipos de lavados, uno de los cuales se realiza sobre los grupos I y III, mientras que el otro se lleva a cabo sobre los grupos II y IV.
El lavado 1 se realizó con agua de grifo y detergente de uso doméstico, asistido con esponja de goma espuma.
El lavado 2 se efectuó con una mezcla de lavandina con agua de grifo, asistido por una esponja de goma espuma.
Aplicación de los reactivos:
El “REACTIVO 1” (Bluestar® Forensic), fue aplicado sobre los soportes que conforman el grupo I (toalla I, cerámica I, llave I y madera I), los cuales han sido sometidos al “LAVADO 1”; como así también sobre los soportes pertenecientes al grupo II (toalla II, cerámica II, llave II y madera II), que en este caso fueron limpiados con el “LAVADO 2”.
Por otra parte, el “REACTIVO 2” (Luminol casero preparado mediante la fórmula de Grodsky), se dispersó sobre los soportes que pertenecen al grupo III (toalla III, cerámica III, llave III y madera III), los cuales fueron sometidos al “LAVADO 1”, como así también sobre los soportes pertenecientes al grupo IV (toalla IV, cerámica IV, llave IV y madera IV), los cuales fueron sometidos al “LAVADO 2”.
Levantamiento de las muestras:
Existen diversas técnicas de levantamientos de muestra, sin embargo, para este trabajo se consideraron dos técnicas en base a la superficie de los soportes involucrados.
Por un lado se eligió la técnica de sustracción, la cual consiste en extraer una pequeña porción de material constitutivo del soporte para ser analizado con posterioridad; y por otro lado la técnica de transferencia, cuyo objeto es transferir la sustancia hallada sobre una superficie determinada a otra mediante la implementación de un elemento absorbente, en este caso se utilizó un hisopo con torunda de algodón el cual fue embebido en un solvente adecuado (agua destilada), con el objeto de humedecer el hisopo para luego aplicarlo en la superficie deseada y mediante un suave frotado permitir la transferencia de material biológico de un soporte a otro.
Procesamiento de las muestras:
Se realizó la tipificación de ADN de cada una de las muestras extraídas anteriormente de los soportes involucrados y de la muestra de referencia obtenida del voluntario masculino, con el objeto de analizar los posibles perfiles genéticos y verificar la condición de cada uno, es decir si están o no completos.
Para ello se llevó a cabo la siguiente serie de técnicas de biología molecular:
Extracción de ADN:
La extracción del ADN se realizó a partir de las DIECISEIS (16) muestras tomadas tanto de las telas/toallas e hisopos, a las cuales se las identifico como “TOALLA I”, “TOALLA II”, “TOALLA III” y “TOALLA IV”; “CERÁMICA I”, “CERÁMICA II”, “CERÁMICA III” y “CERÁMICA IV”; “LLAVE I”, “LLAVE II”, “LLAVE III” y “LLAVE IV”; “MADERA I”, “MADERA II”, “MADERA III” y “MADERA IV” y un blanco de extracción por corrida.
La extracción de ADN consiste en la separación de dicha molécula del resto de la matriz, con el fin de amplificarla posteriormente.
Cuantificación de ADN:
La cuantificación de ADN se realizó mediante Real Time PCR con el Kit Quantifiler Trio DNA Quantification, de acuerdo a las recomendaciones del fabricante (Thermo Fisher Scientific), usando el equipo de PCR en tiempo real Applied Biosystems 7500. En síntesis, en este procedimiento se amplifica y cuantifica ADN autosómico (fragmento corto y fragmento largo) y de cromosoma-Y, como así también un control interno de amplificación, por medio de sondas y primers específicos para cada fragmento blanco, lo que determina que sea un método muy sensible para arribar a la cantidad de ADN presente en la muestra con gran certeza.
Amplificación de ADN:
En esta etapa se emplea el método PCR punto final usando el equipo VeritiR Thermal Ciclar (Thermo Fisher Scientific). Se amplificaron por un lado STRs autosómicos con el kit comercial GlobalFiler Plus (Thermo Fisher Scientific-Applied Biosystems) y además STRs de Cromosoma Y utilizando el Kit Yfiler Plus (Thermo Fisher Scientific-Applied Biosystems). Lo que se intenta logar en esta etapa es amplificar regiones de interés generando millones de copias de estas secuencias, para luego evidenciarlas mediante electroforesis capilar.
El protocolo de amplificación por PCR consistió en 25-30 ciclos, produciendo por cada ciclo los tres pasos que se detallan:
1)- desnaturalización, por calor se desnaturalizan (separan) las cadenas de ADN.
2)- alineamiento de los iniciadores o primers que se unen por complementariedad de bases y delimitan las regiones que se van a amplificar.
3)- extensión, en cada ciclo de PCR se duplica la secuencia blanco, por lo que en 25 a 30 ciclos teóricamente habrá millones de copias, facilitando su análisis.
Para ver el procedimiento puede descargar el trabajo completo haciendo clic aquí
Obtención de los perfiles genéticos:
Se llevó a cabo por el método de Electroforesis Capilar y se analizó en el secuenciador automático ABI 3500 de ocho capilares (Thermo Fisher Scientific-Applied Biosystems). Este método consiste en separar en forma rápida y precisa el producto amplificado, generando un electroferograma (representación gráfica de la corrida)
Procesamiento de los datos:
En esta última etapa se representan los resultados de todas las muestras analizadas en el Analizador Genético. Luego, las mismas fueron procesados en el software de análisis de datos GeneMapper que permite detectar los picos (alelos) presentes en cada una de las muestras, asignándole un tamaño estimado de pb (pares de bases) a cada pico y realizando la asignación alélica de estos picos, de acuerdo a la escalera alélica utilizada, obteniéndose así el correspondiente electroferograma con la información de información genética amplificada de la muestra.
Luego, se efectuaron comparaciones de los resultados, con el fin de constatar la correspondencia entre las muestras recolectadas de los diferentes soportes y la muestra de referencia.
Dichos resultados se resumen en la siguiente tabla.
Resultados:
Conclusiones:
Los soportes utilizados en el presente trabajo no mostraron influencia en la recuperación de perfiles genéticos analizables luego del tratamiento de lavado aplicado, lo que tiene concordancia con los trabajos previos detallados en el apartado de discusión.
En base a lo expuesto en la discusión respecto a la falta de bibliografía en la que se evalúe el efecto conjunto de agentes blanqueadores y reactivo Luminol como en el presente trabajo, se concluye que la combinación de estos, sin distinción del reactivo Luminol utilizados, produjo una desnaturalización y/o destrucción de muestra; ya que solo se pudo obtener un perfil genético analizable de STRs autosómico del 68,75% y 43,75% de STRs de Cromosoma Y, de las muestras analizadas.
A la hora de evaluar la aplicación más conveniente del reactivo Luminol, se considera que la combinación menos lesiva fue la del reactivo Luminol casero preparado mediante la fórmula de Grodsky; ya que con ambos agentes químicos (detergente y lavandina), fue posible recuperar un perfil genético analizable del 37.5 % de las muestras.
En cuanto a la cantidad de ADN extraído del 100% de las muestras estudiadas, solo el 68,75% de las misma presentaron suficiente cantidad de ADN tanto para STRs autosómico, como así también STRs de Cromosoma Y. la calidad del perfil genético obtenido en cuanto a la cantidad de alelos detectado se arribó a que la misma fue del 100%, ya que para 68.75% de las muestras analizadas, permitió la correspondiente identificación humana.
En síntesis, este trabajo reveló que los reactivos de Luminol ensayados bajo las condiciones evaluadas no destruyen al ADN, ya que fue posible recuperar un perfil genético analizable en el 68,75% de las muestras ensayadas, haciendo posible la correcta identificación humana. Sin embargo, en el 31,25 % las muestras analizadas, no se logró la recuperación de un perfil genético debido a que presentaron bajas concentraciones de ADN, por lo tanto, fueron excluidas del trabajo. Concluyendo a que el bajo rendimiento referente a la concentración de ADN puede o no ser atribuido a los lavados y/o la combinación de éstos con los reactivos Luminol.
Finalmente, tal como se mencionó anteriormente en el apartado de la discusión de resultados, se propone que a futuro se realicen otras investigaciones de carácter complementario referentes a los interrogantes que se fueron presentando, los cuales excedieron el enfoque principal de este trabajo y por lo tanto deben ser estudiados en profundidad con el objeto de generar nuevos aportes científicos.
Trabajo de investigación realizado por la Licenciada en Criminalística Yesica MARQUEZ.